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    Standard Neue Beiträge im Thread Design of protein-small molecule binding

    Es wurde ein neuer Thread aufgemacht und hier kommt dann gleich der erste Beitrag

    Rocco Moretti - Message 70651 - Posted 27 Jun 2011 17:50:30 UTC

    Hello,

    My name is Rocco Moretti, and I'm a postdoc in the Baker Lab.

    Chances are you might see something a little different when you look at your screensaver in the near future. The jobs I'm running on Rosetta@home aren't structure prediction, or protein-protein interaction design, but protein-small molecule interaction design. (These work units are tagged with "LigDes", standing for "ligand binding protein design") So in addition to the normal protein chain in the viewer, you'll also see a blobby representation of the small molecule.

    With the current set of work units, we're looking at redesigning a genetic regulator to recognize different small molecules. All organisms must control their gene expression in response to different molecules in their environment - to turn on genes to take advantage of a new food source, for example. There's a number of different ways of doing this, but one of them is for proteins to recognize the small molecules, bind to them, and then have that bound protein go on to regulate genes. For example, the commonly used LacI repressor binds to DNA in its un-liganded state, turning off the genes it's bound to. When it recognizes and binds its small molecule, this changes the protein enough so that it no longer binds to DNA, allowing the gene it was bound to to be expressed. The LacI protein functions as a switch, effectively turning on genes only in the presence of small molecules.

    What we want to do is take such a naturally occurring protein regulator and change it so that it binds not to its native small molecule, but to another, different small molecule. The hope is that this way we could create a set of different gene switches which are responsive to different small molecules. This should be of benefit to the field of synthetic biology, allowing for the control of multiple genes with multiple different small molecule regulators.

    We're actually doing this research in collaboration with researchers in George Church's lab at Harvard, who have a way of "easily" turning large numbers of protein sequences in the computer to actual proteins in the test tube. As these proteins will directly control gene expression, it's very simple to test a large number of different variants very rapidly. That's where you come in - the number of variants we're looking to test is much larger than we typically produce locally, but should be a cakewalk for Rosetta@home. The current plan is that almost all of the designs that we get back from Rosetta@home will be directly tested in the laboratory.

    _____________________

    Übersetzung: - Susanne

    Hallo,

    Ich heisse Rocco Moretti und bin ein Postdoktorand im Baker Labor.

    Demnächst könnte es sein, dass ihr etwas anderes auf euren Bildschirmschonern seht. Die Jobs, die ich auf Rosetta@home laufen lasse, sind keine Strukturvorhersagen oder Protein-Protein Interaktionsdesigns, sondern Protein – Kleine Moleküle – Designs. Diese Arbeitseinheiten sind mit “LigDes” gekennzeichnet, was für “Ligandbindenes Proteindesign” steht). Dabei gibt es dann auch neben der bisherigen Proteinkette auf dem Bildschirn eine verkleckste Darstellung des kleinen Moleküls zu sehen.

    Mit den derzeitigen WUs versuchen wir einen genetischen Regulator erneut so zu designen um verschiedene kleine Mokeküle zu identifizieren. Alle Organismen müssen ihre Genexpression in Antwort auf verschiedene Mokeküle in ihrer Umgebung kontrollieren – um die Gene in Reaktion auf eine beispielsweise neue Nahrungsquelle einzuschalten. Dies kann auf verschiedene Wege erreicht werden, aber einer davon ist, wenn das Protein die kleinen Moleküle erkennt, sich an sie bindet, und sich das somit gebundene Protein bei der Genregulation einsetzt. Als Beispiel der allgemein benutzte LacI Repressor, der an das DNA im Ligandvorstadium bindet und dabei die Gene abschaltet, an die er gebunden ist. Wenn er sein kleines Molekül erkennt und sich daran bindet, ändert das das Protein soweit, dass es nun nicht mehr an das DNA bindet, und erlaubt somit dem Gen, an das es gebunden war, sich auszudrücken. Das LacI Protein funktioniert wie ein Schalter, indem es die Gene nur in Gegenwart von kleinen Molekülen einschaltet.

    Wir planen jetzt, uns solch einen naturgegebenen Proteinregulator vorzunehmen und so zu verändern, dass er nicht an sein natives kleines Molekül bindet, sondern an ein ganz anderes kleines Molekül. Die Hoffnung besteht darin, dass wir somit einen Satz von verschiedenen Genschaltern entwickeln können, die auf unterschiedliche kleine Moleküle eingehen. Davon sollte der Bereich der synthetischen Biologie profitieren, wobei eine Mehrzahl an Gene mit einer Mehrzahl von unterschiedlichen kleinen Mokekülregulatoren kontrolliert werden können.

    Wir führen diese Forschung in Zusammenarbeit mit Kollegen des George Church Labors von Harvard aus, die imstande sind, “ganz einfach” groβe Anzahlen von Proteinsequenzen vom Computer in wirkliche Proteine im Reagenzglas umzusetzen. Da diese Proteine die Genexpression direkt kontrollieren, ist es sehr leicht, eine groβe Anzahl von verschiedenen Varianten blitzschnell zu testen. Und dazu brauchen wir euch – die Anzahl der Varianten, die wir zu überprüfen vorhaben, ist viel gröβer, als die, die wir typischerweise intern produzieren, aber das sollte für Rosetta@home ein Kinderspiel sein. Der derzeitige Plan sieht so aus, dass fast alle der von Rosetta@home zurückerhaltenen Designs direkt im Labor getestet werden.
    Geändert von cappy (28.06.2011 um 22:04 Uhr)


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    #2

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    Rocco Moretti - Message 71801 - Posted 15 Dec 2011 20:25:40 UTC - in response to Message ID 71800.

    Now, as roughly 6 months passed, I would like to kindly ask you for some summary / follow-up post about your successes, failures and general work so far.

    Unfortunately not much "headline" level news to report. Such is science at times.

    The collaborators who are doing the experimental testing of the designs have been working on improving the assay, so that we can get a clean "good binder"/"bad binder" readout once we start testing the synthesized proteins.

    Another issue has been that the high-throughput gene synthesis technique we anticipated using isn't up to the task of synthesizing the full binding protein. (Specifically, the region over which there's variation is too large to synthesize in a single piece.) We've come up with a scheme where we'll break the binding protein gene into several regions, select the most common sequences for each piece, synthesize each of those shorter regions separately, and then randomly combine (in a test tube) those sections. Hopefully this will overcome the synthesis length limitation.

    Thanks for your continued interest in the project! I'll continue to update you whenever there's more information to report.
    Übersetzung: -

    Rocco Moretti antwortete am 15.12.11 auf den Post ID 71800 von Aegis Maelstrom, der endete: "Nun, da jetzt etwa 6 Monate verstrichen sind, möchte ich Sie höflichst um eine Zusammenfassung/ einen Fortsetzungspost Ihrer Erfolge, Misserfolge und generellen Arbeiten bitten."

    Rocco Morettis Antwort lautete: -

    Leider gibt es nicht viel Neues zu berichten was in die Schlagzeilen gehört. So geht das manchmal in der Wissenschaft.

    Diejenigen, die bei dem experimentellen Testen der Designs zusammenarbeiten, haben sich damit beschäftigt die Analyse zu verbessern, um zu erwirken, dass wir eine klare Anzeige betr. “guter Binder”/“schlechter Binder” erhalten, sobald wir die synthetischen Proteine testen.

    Dazu kommt noch, dass sich leider die Gensynthese mit der groβen Durchflussleistung, die wir hatten anwenden wollen, nicht dazu eignet, das gesamte bindende Protein zu synthetisieren. (Insbesondere die Region, in der die Variation zu groβ ist, um sie in einem Stück zu synthetisieren.) Wir haben ein System entwickelt, mit dem wir das Gen des bindenden Proteins in einzelne Bereiche unterteilen, dann die geläufigsten Sequenzen jedes Teilstücks heraussuchen, danach jede der gekürzten Regionen separat synthetisieren und darauf folgend diese Regionen willkürlich (in einem Reagenzglas) kombinieren. Es wird erhofft, somit das synthetische Längenlimit zu überwinden.

    Danke für Euer fortgesetzes Interesse an diesem Projekt! Ich werde Euch weiterhin auf dem Laufenden halten wann immer es neue Informationen zu berichten gibt.
    Geändert von Susanne (18.12.2011 um 19:14 Uhr) Grund: typo, Texteinfg.


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    nach einigen Jahren mal wieder ein Update: -

    Rocco Moretti - Message 79517 Posted 11 Feb 2016 19:56:02 UTC - in response to Rocco Moretti Message ID 70651 Posted 27 Jun 2011 17:50:30 UTC .

    Finally, several years later, I can finally give an update on this project.

    We were able to take the massive numbers of designs which you were able to generate (and truly, there were a lot - at one point we even had disk space issues with storing all of them), and examine all the mutations which were suggested. The initial plan was to make and test the designs produced by Rosetta@home as-is, but due to limitations in the gene synthesis platform in the Church lab, we had to break up designs into parts (based on region of the binding site) and make consensus designs based on those parts.

    But with the processed designs in hand, our collaborators in the Church lab were able to express and test them for effectiveness in small-molecule-responsive gene regulation. From these computational designs, we were able to get workable variants for three of the four targets run on Rosetta@home, including sucralose. (The gentiobiose designs mentioned in the paper were not run on Rosetta@home.) Using standard (non-computational) molecular biology techniques, we were able to further optimize a protein to specifically bind sucralose - which also shows a response towards sucrose which is comparable to how the wild type protein responds towards the normal IPTG ligand.

    The scientific paper describing the results is in this month's issue of Nature Methods: Taylor, et al. (2016) "Engineering an allosteric transcription factor to respond to new ligands", Nat. Meth. 13, 177–183. (pdf). http://www.nature.com/nmeth/journal/...meth.3696.html And here's a less technical write-up on phys.org.

    Thanks again to everyone who donated their computer time for Rosetta@Home, and who made this work possible!

    Übersetzung: -

    Rocco Moretti - Message 79517 Posted 11 Feb 2016 19:56:02 UTC - in Antwort auf Rocco Moretti Message ID 70651 Posted 27 Jun 2011 17:50:30 UTC .

    Ein paar Jahre sind vergangen und ich bin nun endlich in der Lage über dieses Projekt ein Update zu liefern.

    Es ist uns gelungen, die riesig groβe Anzahl an Designs aufzunehmen, die von euch erzeugt wurden (und wirklich soviele – dass wir einmal sogar Festplatten-Speicherprobleme hatten) und daran alle angedeuteten Mutationen zu überprüfen. Wir wollten ursprünglich so vorgehen, die von Rosetta@home produzierten Designs so wie sie erschienen, zu entwickeln, aber durch Einschränkungen im Gen-Synthesen Betriebssystem im Church Labor waren wir gezwungen, die Designs in Einzelteile zu zerlegen (basierend auf die Region der Bindungsstelle) und übereinstimmende Designs zu erzeugen, die auf diese Teile basierten.

    Unsere Mitarbeiter im Church Labor konnten dann aber diese bearbeiteten Designs herstellen und ihre Funktionsfähigkeit testen betr. der Kleinmolekülreaktions-Gensteuerung. Von diesen rechnerischen Designs war es uns möglich, Varianten von drei der vier Zielobjekten durch Rosetta@home zu erzeugen inklusive Sucralose. (Die Gentiobiose-Designs, die im Bericht erwähnt wurden, sind nicht mit Rosetta@home erzeugt worden.) Durch Anwendung von herkömmlichen Molekularbiologischen Arbeitsweisen (nicht-rechnerisch) konnten wir ein Protein weiter optimieren um speziell Sucralose zu binden – welches auch auf Sucrose anspricht, was auch mit der Reaktion des ungebändigten Proteins mit dem normalen IPTG Liganden verglichen werden kann.

    Der wissenschaftliche Beitrag in der Ausgabe vom gleichen Monat in Nature Methods beschreibt die Ergebnisse: Taylor, et al. (2016) "Engineering an allosteric transcription factor to respond to new ligands", Nat. Meth. 13, 177–183. (pdf)" http://www.nature.com/nmeth/journal/...meth.3696.html. Und hier ist ein leichterer wissenschaftlicher Text phys.org.

    Nochmals vielen Dank an diejenigen von euch, die ihre Computer für Rosetta@home einsetzten und somit diese Arbeit ermöglichten!
    Geändert von Susanne (10.04.2016 um 18:12 Uhr)

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